De Rusthof werd in 1831 gesticht door mevrouw E. M. M. Groen van Prinsterer-van der Hoop. Zij was in 1807 geboren in Groningen en huwde in 1828 Guillaume (Willem) Groen van Prinsterer, de bekende historicus en politicus. Hun leven stond in teken van het christelijk geloof en christelijke naastenliefde. Zij richtte samen met Caroline de Clercq in 1831 in de Nobelstraat een Naaischool op voor behoeftige meisjes, die de school reeds hadden verlaten, maar toch verder naaionderwijs wensten. Aan de leerlingen werd les gegeven in het breien en het naaien van fijn linnengoed en tijdens de lessen werd uit de bijbel voorgelezen. De school is in 1846 naar de Parkstraat verplaatst. De belangstelling was enorm, met in 1852 reeds meer dan 150 leerlingen. Na invoering van de Leerplichtwet daalde het aantal leerlingen en is de school op 19 juli 1932 gesloten.
In 1841 kocht men aan de oostzijde van de Parkstraat een grote tuin met twee huizen en bouwde daar acht huizen bij. Daar zorgde men voor goedkope huisvesting voor dienstboden. De Rusthof is thans te vinden naast de rooms-katholieke kerk in de Parkstraat. Hier is een deur die toegang geeft tot het hofje.In 1865 stelde Betsy Groen van Prinsterer het huis in de Kazernestraat 28 ter beschikking aan mevrouw S.K. de Bronovo om hier een kliniek voor weduwen en ongehuwde vrouwen te vestigen. Dit was de start van het huidige Ziekenhuis Bronovo. Nadien werden ook Kazernestraat 26 en 30 aan de kliniek toegevoegd. De diaconessen die in de inrichting werkten, woonden tot 1879 op de Rusthof. In dat jaar werd de Diaconesseninrichting verplaatst naar de Laan van Meerdervoort. De huisjes van de hof werden opnieuw bestemd voor oude vrouwen. Een belangrijk deel van de nalatenschap van het kinderloze echtpaar Groen van Prinsterer werd vermaakt aan de vereniging voor de instandhouding van Rusthof en Naaischool.
In 1980 is de vereniging omgezet in een stichting. In 1986 nam het bestuur het initiatief voor een grote renovatie van de hof.